§ 11. методы изучения клетки. общий план строения клетки

Прочие приемы

Авторадиография дает возможность проследить присутствие того или иного химического компонента в клетках. Для этого делают специальную радиоактивную метку на молекуле, заменяя при этом на радионуклид отдельно взятый атом. Далее, применяя особый счетчик, находят местоположение вещества. Также в определении локализации помогает и засвечивание фотопленки. Избирательное действие реактивов и красящих веществ наблюдается в случае использования методов цитохимии.

Существует также рентгеноструктурный анализ. Если кратко охарактеризовать этот метод, то он необходим для выявления пространственного положения групп атомов в молекулах или отдельных образцов. Такой прием используется при работе с белками, структурой ДНК и другими клеточными включениями. Микрохирургия также является одним из используемых сегодня методов изучения клетки. При этом производится удаление тех или иных компонентов, пересаживание клеток друг друга, внедрение разных веществ в форме микроинъекции и т. д. Целью здесь выступает изучение деления, специализации и дифференциации клеток и их групп.

С целью формирования современной естественно-научной картины мира учащимся 5 класса на уроке биологии освещают тему истории изучения клетки. Также преподаватели рассказывают о современных методах исследования. Рассматриваемая тема включается в перечень вопросов по ЕГЭ по биологии.

Учащиеся медицинских колледжей и университетов также изучают данную тему. Для них разработаны специальные пособия.

Метод центрифугирования

Цитоцентрифуга PrO-CytLCD

Этот способ получил широкое распространение при исследовании детального химического состава клеточных органелл. Метод предусматривает наличие подготовительного этапа, во время которого образец дробится и пропускается через гомогенизатор, для получения однородной среды. Затем полученное вещество помещается в цитологическую центрифугу, при вращении ротора которой, под воздействием центробежной силы, происходит разделение органелл на слои и их осаждение на дно пробирки.

Центрифуга PrO-PRP S

Полученные фракции изучаются под микроскопом. Данный метод применяется при проведении одного из наиболее распространенных цитологических анализов – ПАП-теста (теста Папаниколау), при этом специфичность исследования максимально приближена к 100%

Однако здесь важно правильно подобрать оборудование. Например, центрифуга, используемая для плазмолифтинга, не подойдет для обработки образцов, поскольку в ней не поддерживается работа с цитороторами.

Результаты исследования

В современной медицине цитологические исследования являются наиболее точной группой анализов. Средняя чувствительность всех методов составляет порядка 94%. Данный показатель отвечает за способность того или иного способа исследований не выдавать ложноотрицательных результатов. Другая важная характеристика – специфичность, обозначающая вероятность отсутствия ложноположительного результата, в цитологических анализах не опускается ниже 99%. Т.е. данная группа методов крайне редко может выдать данные о наличии заболевания у людей, которые на самом деле не имеют тех или иных проблем со здоровьем.

Продолжительность проведения анализов зависит от нескольких факторов, включающих загруженность и оснащенность лаборатории, квалификацию персонала и т.д. В обычном случае время ожидания результатов достигает двух-трех дней. Если лечащему врачу информацию требуется безотлагательно, то исследования могут быть выполнены в течение часа.

При наличии в образцах измененных клеток, возбудителей болезней, следов воспалительных процессов и других аномалий, лаборант указывает наличие дефектов в бланке. Злокачественность клеток указывается степенями – первая – отсутствие аномалий, пятая – присутствие раковых клеток. Окончательная расшифровка результатов должна производиться врачом, заказавшим исследование.

Виды микроскопических исследований

С помощью микроскопа можно исследовать различные клетки человеческого организма. Для исследования берутся различные биологические материалы – кровь, моча, сперма, мазки, отделяемое слизистых и т.д.

В медицине сегодня проводятся несколько видов микроскопических исследований – стереоскопическая, инфракрасная, люминесцентная, ультрафиолетовая, рентгеновская, поляризационная микроскопии.

Анализ крови позволяет определить количественный и качественный состав крови, соотношение ее форменных элементов, выявить атипичные или незрелые клетки. Микроскопический анализ мочи позволяет определить наличие солей, клеточных элементов и цилиндров, исследование позволяет выявить имеющиеся проблемы в водно-электролитном балансе организма, также в нарушения процессов обмена веществ.

Несмотря на то, что сегодня широко используются специальные электронные аппараты для проведения лабораторных исследований – анализаторы, визуальный осмотр биологических материалов для выявления атипичных или незрелых клеток по-прежнему выполняется медицинским персоналом с помощью микроскопов.

В медицинских центрах «Гайде» можно пройти все виды лабораторных исследований. В любое удобное время и по доступной цене можно выполнить любые виды лабораторной диагностики, и по ее результатам получить квалифицированную консультацию специалиста по профилю заболевания. Записаться на консультацию можно по телефонам, указанным на сайте.

Культивирование клеток

Культивирование нередко требуется для исследования клеток. Это означает, что их приходится выращивать, задействовав при этом питательные среды. Такой подход дает возможность изучить их потребность в тех или иных веществах, а также молекулы, выделяемые такими клетками. Организмы, которые подвергают культивированию, зачастую выделяют полезные для человека вещества в окружающую среду.

Примером могут послужить антибиотики. Чтобы обеспечить рост необходимых организмов, требуется придерживаться стерильности. Это значит, что любые другие микроорганизмы и их споры не должны попадать в питательную среду. Достигается это применением одноразовых сосудов. Это может быть, допустим, чашка Петри. Если закрыть ее крышкой, микробы из воздуха не могут попадать внутрь. Но есть и многоразовое оборудование для исследования клеток, которое приходится периодически стерилизовать.

Для работы с такими сосудами требуется применение резиновых перчаток, а также спецодежды. Хранят их в шкафах, где воздух подвергается фильтрации. Также применяется здесь и проточная система циркуляции для большей надежности. Во время любых манипуляций поблизости стоит зажженная горелка.

Биохимический метод

Отдельные клетки можно гомогенизировать, чтобы получить из них необходимые вещества. Сущность этого метода изучения жизнедеятельности клетки состоит в том, что соединение измельчается, пока не примет консистенцию однородной кашицы. Далее проводятся другие манипуляции, в том числе обработка специальными веществами.

Так называемый метод меченых атомов часто используются в биохимии. Его целью является изучение метаболизма. При этом производится введение соединений в организме. В них присутствуют специальные радиоактивные изотопы, которые в дальнейшем обнаруживаются в различных веществах. Это дает возможность отследить их превращение, изучая параллельно биохимические реакции, протекающие в живых организмах.

Техника центрифугирования

Для разделения по плотности различных структур клеток и органоидов применяют центрифугирование. При этом используют специальные приборы, в которых осуществляется раскручивание клеток. Ключевым компонентом центрифуги является ротор. Скорость его вращения может достигать сотен тысяч оборотов за минуту. Это обеспечивает стремительное оседание всего содержимого пробирки и разделение на отдельные частицы. Чтобы обеспечить оседания частиц по плавучей плотности, применяются плотные солевые растворы.

Если для дифференциального центрифугирования применяется, допустим, хлористый цезий, формируется градиент плотности. Это значит, что происходит некое разделение, в результате чего менее плотные частицы располагаются вверху, а более плотные — внизу. При помещении различных частиц в этот раствор во время обработки центрифугой они могут останавливаться в определенном слое. Имеется в виду область, где плавучая плотность указанных частиц соответствует плотности окружающего их раствора.

Световая микроскопия

Световой микроскоп – прибор для рассмотрения объектов.  Он представляет собой оптическую систему, состоящую из следующих элементов:

• Конденсатор
• Объектив
• Окуляр

Принцип работы светового микроскопа

Пучок света от источника освещения собирается в конденсаторе и направляется на объект. Прошедшие сквозь объект лучи света попадают в систему линз объектива. Таким образом строится первичное изображение, которое увеличивается линзами окуляра.

Объектив является главным элементом оптической системы микроскопа, который определяет возможности прибора. В современных микроскопах используются сменные объективы, позволяющие изучать клетки при разной степени увеличения.
Важнейшая характеристика микроскопа – разрешающая способность. Разрешающая способность объектива –это минимальное расстояние между двумя точками, которые видны раздельно; вычисляется по формуле:

λ – длина волны света, используемого для освещения объекта, n – коэффициент преломления среды, α – угол между оптической осью объектива и наиболее отклоняющимся лучом, попадающим в объектив.

Из формулы следует:

• чем меньше длина волны, тем выше разрешение (тем меньшего размера объект можно увидеть)
• чем выше нумерическая апертура объектива (n⋅sin α), тем выше разрешение

При использовании источников освещения в видимой области спектра (400-700 нм), максимальное разрешение микроскопа не превышает 200-350 нм (0,2-0,35 мкм).

При использовании источников освещения ультрафиолетовой области спектра (260-280 нм), максимальное разрешение микроскопа не превышает 130-140 нм (0,13-0,14 мкм), что является пределом теоретического разрешения светового микроскопа, которое определяется волновой природой света.

Таким образом, световой микроскоп увеличивает разрешающую способность глаза в 1000 раз (разрешающая способность невооруженного глаза приблизительно 0,1 мм).

Метод «темного поля» (ультрамикроскопия)

Метод ультрамикроскопии позволяет увидеть объекты величиной менее 0,2 мкм. Метод основан на эффекте Тиндаля: при боковом освещении в клетке светятся мельчайшие частицы, от которых отраженный свет попадает в объектив микроскопа. Ультрамикроскопия успешно используется для изучения живых клеток.

Метод фазово-контрастной микроскопии

Большинство компонентов клетки мало отличаются по коэффициентам преломления и поглощения от среды (вода, тканевый раствор) и друг от друга, поэтому они мало контрастны и плохо различимы при рассмотрении клетки в проходящем свете. Для исследования клеточных структур меняют освещенность, жертвуя четкостью изображения, а также используют специальные приборы и методы.

Среди этих методов – фазово-контрастная микроскопия. Метод основан на различии (хоть и небольшом) в плотности и светопреломлении клеточных компонентов. Свет, проходя сквозь них, изменяет фазу, что неуловимо человеческим глазом, так как глаз чувствителен только к изменению интенсивности. Изменение фазы преобразовывается в изменение интенсивности (яркости), зависящей от амплитуды волны. В объектив фазово-контрастного микроскопа встроена специальная пластинка, проходя через которую луч света испытывает дополнительный сдвиг фазы колебаний. При построении изображения происходит взаимодействие лучей, находящихся в одной фазе либо в противофазе, но обладающих разной амплитудой. Таким образом, создается светло-темное контрастное изображение объекта.

Интерференционная микроскопия

В интерференционном микроскопе пучок параллельных световых лучей от источника разделяется на два потока: один проходит через объект и меняет фазу колебания, другой идет мимо объекта. В объективе два потока соединяются и интерферируют между собой. В результате интерференции образуется изображение, на котором компоненты клетки в зависимости от плотности имеют разную контрастность.

Поляризационная микроскопия

Поляризационный микроскоп позволяет исследовать объекты, обладающие изотропией – упорядоченной ориентацией субмикроскопических частиц (миофибриллы, волокна веретена деления). В оптическую систему такого микроскопа входят поляризатор и анализатор, представляющие собой призмы, которые пропускают световые волны с определенной плоскостью поляризации. Помещенный между призмами объект, который обладает двойным лучепреломлением, будет виден как светящийся на темном поле.

Современная клеточная теория

Со времени основания клеточной теории осуществлялось развитие учения о клетке как элементарной микроскопической структуре организма. К первой половине 20 века стало ясно первоочередное значение клеточных структур в передаче наследственной информации. Благодаря успехам микроскопической техники обнаружено сложное строение клетки, описаны ее части и их функции. Описан способ образования новых клеток путем деления материнской клеточной структуры.

Все открытия в цитологии были учтены при разработке положений современной клеточной теории.

Рассмотрим сложившиеся к настоящему времени основные положения клеточной теории.

Первое положение клеточной теории изложено еще Теодором Шванном и лишь немного претерпело изменения. Ученый утверждал, что растительный и животный организм состоит из клеточных структур. Со временем науке стали известны и другие царства живых организмов. Поэтому данное положение было сформулировано по-иному.

В чем же суть первого положения современной клеточной теории? Всем известно,что организмы обладают клеточным строением, помимо этой структуры жизнь не существует. Сейчас известны только одни неклеточные существа – вирусы, однако к жизнедеятельности они способны только при проникновении внутрь клетки.

Причем согласно клеточной теории клетка считается функциональной единицей, то есть она способна жить, питаться, осуществлять обмен веществ. В этом она сравнима с целым организмом. 

Второе утверждение клеточной теории говорит о том, что клетки обладают единым планом строения, то есть у всех клеточных структур есть оболочка, ядро, цитоплазма, а также другие части. Им характерен одинаковый состав,представленный такими веществами как белки, липиды, углеводы, нуклеиновые кислоты. Соответственно, при таком сходстве сохраняется и единый принцип жизнедеятельности.

Третий постулат современной клеточной теории сформулирован еще Рудольфом Вирховым. Именно он утверждал, что клетки могут появляться только из других таких же структур. В дальнейшем это подтвердилось наукой и до настоящего времени иных способов образования клеток не выявлено.

Согласно клеточной теории клетка – это основная единица организмов, хотя она способна и к самостоятельной жизнедеятельности. Действительно, мы знаем, что существуют одноклеточные существа, где клетка исполняет роль целого организма. На клеточном уровне обнаруживаются все свойства живого: способность к саморегуляции, размножение, рост и развитие, обмен веществ. Однако в многоклеточном организме, каждая группа клеток совершает какие-то специфические функции. Такое разделение функций в организме способствовало появлению значительных возможностей для адаптации к среде обитания.

В чем же значение теории клеточного строения организмов для человечества?

Очень хорошо оценил ее роль Ф.Энгельс, обозначив клеточную теорию как одно из главнейших достижений человечества наряду с законом сохранения энергии и эволюционной теорией. В своих трудах он писал, что данное открытие позволило понять единство развития всех живых существ. Однако, клетки способны видоизменяться и это явилось толчком эволюции организмов.

Клеточная теория имела большое значение для становления материалистических представлений в биологии и медицине. Благодаря полученным знаниям развиваются новые области науки – биотехнология, нанотехнология, клеточная инженерия, селекция микроорганизмов.

Наиболее распространённые причины неадекватности мазков

Причина	Чем вызвано	Как избежать
Плохое качество материала, вызванное неправильным взятием мазков	Плохо удалены вагинальные выделения, шейка недостаточно хорошо выведена в зеркалах	Обращение к опытному гинекологу, хорошо владеющему методикой получения цитологического материала
Мало материала. Велика вероятность, что патологические клетки не попали в образец	Недостаточные усилия при надавливании на инструмент при взятии мазка, материал взят не со всей поверхности
Примеси в мазках	Применение перед взятием анализа лекарств, вводимых во влагалище. Интимные контакты, сопровождающиеся выделением сперматозоидов и смазки с презерватива	За 2-3 дня до взятия мазков нужно отказаться от интимных контактов и не вводить лекарства в половые пути. Иначе цитология может показать неправильный результат
Значительная примесь крови	Мазок взят во время критических дней, сразу после родов или аборта	Не сдавать анализы в эти периоды
Большое количество лейкоцитов, мешающее оценке	Мазок взят на фоне выраженного воспалительного процесса	Вначале пролечить острое воспаление. Хронические воспалительные процессы в стадии ремиссии (стихания симптомов) противопоказанием к исследованию не являются

История появления микроскопа

Когда появился первый микроскоп доподлинно неизвестно, но попытки рассмотреть мелкие предметы с помощью увеличительного стекла (двояковыпуклой оптической линзы) предпринимались еще в Древнем Риме.

Первый прибор отдаленно похожий на микроскоп создали голландский оптик Ганс Янсен со своим сыном. Они первыми обнаружили, что при использовании двух линз можно получить многократно увеличенное изображение. Их аппарат напоминал скорее подзорную трубу, но в отличие от последней, не приближал предметы, а увеличивал их.

Увеличительный прибор с вогнутой и выпуклой линзами разработал Галилео Галилей и назвал его «окколино» или «маленький глаз». Термин «микроскоп» предложил друг Галилея Джовани Фабер. Созданные приборы были весьма примитивными и позволяли получить изображение, увеличенное в 9-10 раз.

Первый микроскоп, похожий на современные аналоги, представлял собой металлическую пластину в центре которой располагалась линза. Его создал нидерландский натуралист Антони ван Ливенгук, с его помощью ему удалось сделать важные открытия в строении и функционировании человеческого организма. Он рассмотрел состав крови, структуру тканей, а также увидел бактерии. С помощь микроскопа Левенгука можно было получить увеличение до 270 раз.

К разработке микроскопа внесли свой вклад и русские ученые – Петр Кулибин и Михайло Ломоносов. Последний использовал микроскоп для своих исследований.

Микроскопия

Информацию в таблице «Методы цитологии» рекомендуется дополнить рассказом о световом и электронном микроскопах. Начало изучения микромира связано с изобретением первого светового микроскопа в 1590 году (братьями Янсен). Первые исследования клеточного строения живых организмов с помощью микроскопа выполнили Р. Гук (1665 г.) и А. Левенгук (1696 г.).

Исторически первый метод исследования в цитологии не растерял своего значения до наших дней. Современные методы изучения клетки — фазово-контрастная и интерференционная микроскопия. Разновидности световых микроскопов позволяют различать тонкие детали в живой клетке без ее фиксации и окрашивания.

Особенности метода электронной микроскопии:

1. Внутри электронного микроскопа создают вакуум для того, чтобы пучок электронов не рассеивался.
2. Для исследования необходимы предварительная фиксация и обезвоживание препаратов.
3. После этого объекты заливают в плотную среду для выполнения тончайших срезов при помощи ультратонкого ножа — микротома.
4. Изображение объекта фиксируется с помощью детектора электронов.

Какие методы используются в цитологии, во многих случаях зависит от особенностей объектов. Флуоресцентная микроскопия предназначена для изучения образцов с собственной флуоресценцией, таких как хлорофилл, который в синем свете флуоресцирует красным. Можно исследовать и другие объекты, предварительно окрасив их определенными флуоресцентными красителями.

Флуоресцентный и конфокальный микроскопы позволяют получать изображения некоторых объектов с максимальным разрешением. Трансмиссионный микроскоп дает изображение среза «на просвет». Сканирующий электронный микроскоп дает объемные изображения объектов.

В настоящее время жизнь клетки исследуют на уровне органелл, молекул и атомов. В цитологии используют методы молекулярной биологии, гистологии, микробиологии, биохимии, физиологии. Смежные науки развиваются в тесном контакте друг с другом. Подразделы биологии используют сходные методы исследования, а открытия в одной области оказывают влияние на развитие других дисциплин.

Смотри также: Что изучает цитология: цитология как наука, предмет изучения

Заполнение данных цитограммы

В этом разделе описываются результаты цитограммы – цитологического анализа, который может быть:

• Без особенностей. Цитологическая (клеточная) картина, которую видит врач-цитолог, соответствует возрастной норме и фазе менструального цикла. Такая запись указывает на отсутствие патологических процессов.
• С возрастными изменениями. В климактерическом или предклимактерическом возрасте из-за снижения уровня гормонов и возрастных изменений тканей мазок будет отличаться от результатов цитологии молодой женщины. Наличие только возрастных изменений считается вариантом нормы

Соответствие цитограммы тому или иному заболеванию – интерпретация результатов

В протоколе цитологического исследования имеется раздел, в котором указывается соответствие полученных результатов тому или иному заболеванию. Это позволяет врачу-гинекологу правильно расшифровать анализ и поставить верный диагноз.

Цитологический анализ, соответствующий пролиферации (гиперплазии) железистого эпителия – неблагоприятный признак. Резкое увеличение неправильно развитых (атипичных) железистых клеток указывает на предрак (дисплазию) которая может переходить в злокачественную опухоль – аденокарциному.

Мазок, соответствующий гиперкератозу, указывает на предраковые патологии и онкологию. В норме эпителий шейки матки мягкий, не имеющий жёстких участков. Однако при предраковых поражениях (дисплазии, лейкоплакии, эрозии – эктопии) и злокачественных процессах развитие клеток нарушается, и они становятся плотными – роговыми. Такое состояние называется кератозом (дискератозом). 

Дисплазия

Существует три степени дискератоза:

• Паракератоз – самая слабая степень. В этом случае строение клеток максимально приближено к нормальному.
• Гиперкератоз – при этой патологии клетки становятся плотными и блестящими. Внутри них находится плотное вещество – кератин.
• Акантоз – наиболее выраженная степень дискератоза, при которой происходит прорастание ороговевших клеток вглубь тканей.

При обнаружении признаков гиперкератоза требуется проведение дополнительной диагностики и лечение выявленных патологий. У таких пациенток велик риск развития распространённой (инвазивной) формы рака.

При цитологической картине, соответствующей воспалительному процессу, в мазке присутствуют большое количество лейкоцитов, возбудители половых инфекций, грибки молочницы. В анализе указывается степень выраженности воспаления, которая может быть слабой, умеренной и сильной.

При цитологической картине, соответствующей бактериальному вагинозу, в мазке находят большое количество условно-патогенной флоры – микроорганизмов, которые в обычных условиях находятся в половых путях, не вызывая проблем. Обнаружение условно-патогенной флоры в результатах цитологии говорит о гибели здоровой флоры половых путей и разрастании патологической.

Бактериальный вагиноз развивается при снижении иммунитета, лечении антибиотиками и других причинах, приводящих к нарушению микробного дисбаланса

При воспалительном типе мазка в результатах анализа указывается этиологический фактор – микроорганизмы, которые вызвали такой процесс. Однако цитология не всегда позволяет найти «виновников» болезни. Поэтому таким женщинам нужно сдать анализ на флору, выявляющий возбудителей инфекций. Оптимальный вариант – исследование Фемофлор, применяемое в Университетской клинике для одновременного обнаружения разнообразных патогенных микроорганизмов.

Цитологическая картина, соответствующая атрофическому кольпиту обнаруживается у женщин в постменопаузе. При этом заболевании возникает воспалительный процесс, связанный со снижением уровня гормонов и изменением свойств слизистой половых путей.

У женщин в мазках обнаруживаются:

• Признаки дискератоза (ороговения) разной степени.
• Резервноклеточная гиперплазия – замена истощенного слоя цилиндрического эпителия канала шейки матки резервными клетками, находящимися под ним.
• Плоскоклеточная метаплазия – замещение эпителия шейки матки молодыми клетками. Опасен вариант метаплазии с атипией, который указывает на предраковое перерождение или на раковую опухоль.

Сочетание постоянного вялотекущего воспалительного процесса и климактерического периода значительно увеличивает риск онкологии, поэтому таким женщинам обязательно нужен углубленный врачебный контроль.

Продолжение статьи

1. Интерпретация (расшифровка) результатов цитологии
2. Расшифровка цитологии: интерпретация лицевой стороны единого бланка
3. Расшифровка цитологии: интерпретация результатов цитологического анализа согласно их классификации по Папаниколау
4. Интерпретация зарубежной терминологии, используемой для расшифровки цитологии
5. Расшифровка цитологии: интерпретация протокола цитологического обследования при дисплазии шейки матки
6. Расшифровка результатов цитологии при предраковых патологиях
7. Расшифровка цитологии: что делать, если анализ на цитологию шейки матки выявил предрак
8. Расшифровка цитологии: интерпретация протокола цитологического обследования при раке шейки матки
9. Расшифровка цитологии: дальнейшие действия при плохой интерпретации анализов